8.1. Material
O material necessário para
o bioensaio de cada amostra:
- 1 Balão volumétrico de 500 ml;
- 1 Balão volumétrico de 250 ml;
- Pipeta;
- Gobelés;
- Copos plásticos
- Daphnias
- Medidor de pH
- Meio ASTM ou água mineral com pH neutro
8.2. Preparação das soluções de
ensaio (amostras)
1 A
solução mãe constitui a própria amostra.
2 As
concentrações ou diluições a ensaiar deverão normalmente seguir uma progressão
geométrica. Escolhem-se, sempre que possível, concentrações que permitam obter
várias respostas, conduzindo a uma inibição de crescimento entre 10 e 90%.
Soluções
teste (Efluente - %): 0 / 6.25 / 12.5
/ 25 / 50 / 100
3 As
soluções teste são preparadas por diluição da solução mãe em ASTM, podendo a
solução mãe constituir a solução de ensaio de concentração mais elevada.
Soluções
teste (Amostra):
“100%” : solução mãe
|
“50%” : 250 ml solução cont. “100%” + 250 ml ASTM
|
“25%” : 250 ml solução cont. “50%” + 250 ml ASTM
|
“12.5%” : 250 ml solução cont. “25%” + 250 ml ASTM
|
“6.25%” : 250 ml solução cont. “12.5%” + 250 ml
ASTM
|
“Controlo” : 250 ml de ASTM
|
8.3. Técnica
1.
Começar por encher o balão volumétrico de 500 ml com a solução de teste
(concentração de 100%).
2.
Retirar 250 ml deste balão para um balão volumétrico de 250 ml de capacidade.
Utilizar a solução do segundo balão para encher os 4 recipientes de teste (50
ml por recipiente).
3.
Adicionar 250 ml de meio ASTM aos 250 ml de solução de teste que tinham ficado
no balão de 500 ml, obtendo 500 ml da concentração de 50% da solução.
4.
Retirar 250 ml deste balão para o balão volumétrico de 250 ml de capacidade.
Utilizar esta solução para encher os 4 recipientes teste da concentração de
50%.
5.
Adicionar 250 ml de meio ASTM ao balão de 500 ml …e assim sucessivamente,
diluindo sempre cada solução original a metade para obter a concentração
seguinte (ver esquema I).
6.
Utilizar como controlo meio ASTM, enchendo 4 recipientes com 50 ml desta
solução.
7.
Proceder à introdução de 5 juvenis de D.
magna por recipiente, perfazendo um total de 20 para cada solução teste.
8.
Registar na tabela I os valores de pH, oxigénio dissolvido e condutividade às 0
e 48 horas no controlo e nas várias diluições teste.
9. Os
animais não devem ser alimentados durante o teste e os recipientes devem ser
mantidos a 20±1ºC em luz branca com fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de
escuro.
10. Após 48 horas,
contabiliza-se o número total de dáfnias móveis e imóveis por solução teste,
fazendo o registo na tabela II.
8.4. Cálculo da percentagem de
mortalidade
Calcular a
percentagem de mortalidade a partir da equação:
%
mortalidade = nº de dáfnias mortas
x 100
nº total de dáfnias
8.5. Determinação da 48-CL50
Elaborar
uma reta de regressão (Excel – Microsoft Office), colocando no eixo das
abcissas o logaritmo de base 10 das concentrações e no eixo das ordenadas % de
mortalidade. A partir da equação da reta, calcula-se o valor da concentração
correspondente a % mortalidade = 50. Este corresponde ao valor da CL50.
8.6. Validação dos resultados
Consideram-se
válidos os resultados se forem satisfeitas as seguintes condições no fim do
teste:
a) As
concentrações de oxigénio dissolvido no fim do teste é maior ou igual a 2mg/L
b) A
percentagem de imobilidade dos controlos é menor ou igual a 10%
